關鍵詞：菌種分離純化 純菌種 固體培養基 稀釋平板 涂布平板 平板劃線 液體培養基 單細胞分離 選擇培養分離 菌懸液 培養基 無菌操作

菌種分離與純化是微生物學研究中的關鍵步驟，旨在從復雜的微生物群體中分離出單一、純凈的菌株，為后續的科學研究、工業應用及醫療診斷提供基礎材料。本文概述了菌種分離與純化的多種方法，包括固體培養基分離法（如稀釋倒平板法、涂布平板法、平板劃線法等）、液體培養基分離法、單細胞分離法以及選擇培養分離法等。這些方法各有特點，適用于不同類型的微生物和不同的研究需求。此外，對于特殊類型的微生物，如厭氧菌、嗜熱菌等，還需采用特殊的分離與純化策略。

一、菌種分離與純化的定義

菌種分離純化是指通過無菌操作技術，將所需要的純種菌通過一系列方法從菌落或菌群中單獨分離出來達到純培養狀態，即只含有單一的微生物種類。

二、菌種分離與純化的方法

1. 固體培養基分離法

固體培養基分離法是常用的菌種分離與純化方法，主要包括以下幾種：

（1）稀釋倒平板法：將菌懸液按一定梯度稀釋后，分別取少許不同梯度的菌液（0.5-1.0ml）與熔化的瓊脂培養基搖勻混合，倒入無菌平皿中，待瓊脂凝固后將平板放入恒溫培養箱中倒置培養。如果稀釋得當，平板上會出現分散的單個菌落，挑取這些菌落重復1-2次上述步驟即可獲得純培養。但該方法不適用于熱敏感菌的死亡或好氧菌的純培養。

圖示為稀釋倒平板法

（2）涂布平板法：將熔化的瓊脂培養基倒入無菌平皿中制成平板，待平板冷卻凝固后，將按梯度稀釋的菌懸液加入平板中，每個平板加入0.1ml，并用無菌玻璃涂棒均勻涂布，涂布完成后將平板放入恒溫培養箱中倒置培養。培養結束后挑取單個菌落進行純化。該方法克服了稀釋倒平板法的部分缺點，適用于更多種類的微生物。

圖示為涂布平板法

（3）平板劃線法：用接種環或接種針沾取少量菌懸液，在無菌平板表面連續劃線。隨著劃線次數的增加，微生物細胞數量逐漸減少并分散開來，最終形成單個菌落。重復上述步驟1-2次即可獲得純種菌種。該方法簡便快速，但可能需要多次劃線以確保純培養。常用方法有斜線法、曲線法、方格法、放射法、四格法等。

圖示為平板劃線法

2. 液體培養基分離法

對于某些在固體培養基上難以生長的微生物，可以采用液體培養基進行分離與純化。常用的方法是稀釋法，即將需要培養的微生物在液體培養基中按梯度稀釋，以達到高度稀釋的效果。在同一梯度的多個平行試管中培養后，若大部分試管（一般為超過95%的試管）沒有微生物生長，選擇有微生物生長的試管，其中可能含有純培養物。但該方法只能分離出數量占優勢的微生物種類。

圖示為液體培養基法

3. 單細胞分離法

單細胞分離法是將單個細胞或個體直接從微生物材料中分離出來進行純培養的過程。對于個體較小的微生物如細菌等，可以采用在顯微操作儀下用顯微針挑取的方法進行純培養；對于個體較大的微生物如原生動物等，可以在顯微鏡下用毛細管提取進行純培養；也可以將菌懸液稀釋后制成小液滴，在顯微鏡下挑選只含有一個細胞的液滴進行純培養。該方法通常需要在顯微鏡下進行，利用顯微操作儀或毛細管等工具挑取單個微生物細胞或孢子進行培養。因此該方法對操作技術要求較高，多用于某些高度專業化的科學研究。

圖示為單細胞分離法

4. 選擇培養分離法

根據待分離微生物的特點（如營養需求、生長條件等），設計特定的環境條件進行培養。通過抑制其他微生物的生長或促進目標微生物的生長，使目標微生物在群落中的數量上升，再通過平板稀釋等方法進行純培養分離。這種方法特別適用于從自然界中分離、尋找有用的微生物。

圖示為選擇培養分離法

三、菌種分離與純化的注意事項

1.在進行菌種分離與純化時，必須嚴格遵守無菌操作規范，以防止雜菌的污染。

2.選擇合適的培養基和培養條件對于成功分離與純化微生物至關重要。

3.在挑取單菌落進行純化時，應反復進行多次以確保獲得真正的純培養物。

4.對于某些特殊類型的微生物（如厭氧菌、嗜熱菌等），需要采用特殊的分離與純化方法。

綜上所述，菌種分離與純化是微生物學中的一項重要技術，選擇合適的分離與純化方法并嚴格遵守無菌操作規范，可以成功地從混雜的微生物群體中分離出單一的、純凈的微生物菌株。通過菌種分離與純化，可以獲得具有特定生物學特性和應用價值的微生物資源，為微生物學領域的發展做出重要貢獻。